第4节胰腺癌的液体活检技术_曾宪九胰腺病学（第2版）-QQ阅读轻小说男生网

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第4节　胰腺癌的液体活检技术

阅读要点

1.胰腺癌（PCa）是美国第四大与癌症相关的死因，也是全球第八大死因。近年来，随着手术技术和围术期管理的进步，围术期死亡率逐渐下降，围术期化疗和放疗率有较大提高；然而，对于胰腺癌患者，其预后仍然很差。

2.目前已经认识到，在胰腺癌患者的血液中含有循环肿瘤细胞（CTC）和无细胞核酸（cfNA），例如DNA、mRNA和非编码RNA。近年来，大量科研人员研究其作为新型血液生物标志物的潜在用途，许多研究已经证明了它们作为某些类型癌症的生物标志物的潜在临床应用价值。

3.“液体活检”的概念已得到重点关注，作为替代癌组织活检的检查方法，其主要优点是较少的侵入性，并有助于发现肿瘤发生和发展过程中的遗传和表观遗传学异常。

4.在本文中，我们回顾了有关癌症患者的CTC和cfNAs的相关文献，同时特别关注了关于胰腺癌患者的有关文献，并探讨该领域未来的前景。

一、概述

胰腺癌（PCa）是美国第四大与癌症相关的死因，也是全球第八大死因。近年来，随着手术技术和围术期管理的进步，围术期死亡率逐渐下降，围术期化疗和放疗率有较大提高；然而，对于胰腺癌患者，其预后仍然很差。即便是现在，胰腺癌患者的中位生存时间仅为5~8个月，5年生存率不到10%。

从宏观上讲，虽然手术切除是根治胰腺癌的唯一选择，但大多数患者处于晚期和不可切除阶段，因为胰腺癌在其临床早期阶段，没有显著的临床症状，也无局部侵袭和远处器官转移。此外，胰腺癌对常规化学疗法不敏感。因此，必须在早期和可切除阶段就检测出原发肿瘤，而对于晚期患者，必须进行术前诊断以避免非根治性的手术治疗，并选择合适的治疗方法来提高患者的生存质量。因此，为了给每位患者提供最佳的治疗方案，从早期检测到分期、治疗监测和预后，迫切需要比传统生物标志物更好的生物指标。

在肿瘤发生和发展过程中，有着许多遗传和表观遗传学的异常，并且大量研究已经证实，这些改变在各种癌症中的诊断、治疗和评估预后的过程中可以发挥一定作用。虽然常规的手术或活检标本便可用于研究这些遗传和表观遗传学异常，但是这些获取胰腺组织的方法因其自身的侵入性，不能反复进行。因此，常规的检查方法可能无法反映当前的肿瘤动力学和药物敏感性，这些指标在胰腺癌的治疗过程中很可能会发生改变。但液体活组织检查技术允许反复取样，同时，检查血液中的循环肿瘤细胞（CTC）和（或）无细胞核酸（cfNA），可跟踪肿瘤的当前状态及异质特征，这些信息可能是单次采样无法捕获的。

在过去的几十年中，许多研究表明新兴的基于血液的生物标志物，如CTC和cfNAs，对于各种癌症，包括胰腺癌均有潜在效用。这些新兴的生物标志物被认为具有很大的潜力，并且有助于制订有针对性的治疗策略。在本文中，我们回顾了有关癌症患者的CTC和cfNAs的相关文献，同时特别关注了关于胰腺癌患者的有关文献，并探讨该领域未来的前景。

二、CTC的生物学和检测

在1869年，Ashworth首次在转移性乳腺癌患者的血液中确定了CTC的存在，并在尸体的血液中发现了与原发肿瘤相似的细胞。从那时起，许多研究组织便陆续证明了几种癌症患者外周血中的确存在CTC。目前我们已经认识到，CTC主要来源于原发肿瘤和（或）转移性病变，因此在健康的受试者和非恶性疾病的患者中，CTC极为少见。

CTC通常被认为在表型和基因型上均存在异质性，并且只有2.5%的CTC发生微转移，只有0.01%的CTC发展为微小转移灶。从发生转移到发展为转移灶的过程中，一些CTC经历了上皮间质转化（EMT），其特征是上皮标志物的表达量减少，以及间充质特征的获得，这些特征可以使CTC从上皮细胞标志物的检测中发生逃逸。此外，在每毫升血液中，存在数十亿个血细胞，CTC以极低密度的形式存在于外周血中。因此，针对具有足够灵敏度和特异性的CTC的准确检测，对于研究人员来说是一个重大的技术挑战。

目前，CELLSEARCH系统（Veridex）是使用最广泛的CTC检测平台。该CellSearch系统是唯一获得美国食品和药物管理局批准的CTC检测平台，已经被投入临床，用于转移性乳腺癌、前列腺癌和结肠癌，是一项可靠的诊断和评估预后指标。但是基于EpCAM富集的CELLSEARCH系统可能无法捕获已经发生EMT并恶性潜能增加的CTC，因此CTC的临床应用仍然存在若干问题。所以为了提高检测的敏感性和特异性，尽管CTC具有异质性，但已经开发了用于分离和浓缩CTC的新技术。最近，CTC-Chip被证明可以通过使用肿瘤特异性标记物（例如前列腺癌中的PSA或乳腺癌中的HER2）以及上皮标志物来增加CTC的检测。此外，Saucedo-Zeni等人报道了一种新技术，可以使用通过标准静脉插管插入肘静脉的医疗Seldinger导丝在体内捕获和浓缩CTC。然而，尽管取得了这些进展，但CTC的分离和浓缩技术仍处于发展阶段。

在分离和浓缩CTC后，必须进行鉴定，以检查其遗传和生物学特征。通常要进行各种鉴定，例如免疫细胞化学和分子技术来鉴定CTC。目前，以4′，6′-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐作为核染色剂，CK作为上皮标记物，CD45作为造血标记物的免疫染色方法已被广泛使用。在分子方法中，通常使用定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）来研究CKs、CEA和其他驱动因子的分子特征。

三、胰腺癌患者的CTC检测及其临床相关性

迄今为止，许多研究人员已经开始尝试检测胰腺癌患者的CTC，并使用各种方法证明其临床应用效用。在胰腺癌的早期研究中，曾使用肿瘤特异性和（或）上皮相关的mRNA作为检测CTC的分子靶标。在这些研究中，尽管mRNA的浓度很低，但RTPCR技术已广泛用于检测mRNA。Funaki等首先报道了RT-PCR技术在胰腺癌患者中的临床应用效果。他们证明，外周血中肿瘤特异性的CEA mRNA的检测可用于发现腺癌细胞的血液传播。9例胰腺癌患者中有3例（33.3%）为CEA mRNA阳性，对照组无外周血CEA mRNA阳性。在本研究之后，一些研究小组评估了血液中CEA mRNA在胰腺癌中检测CTC的临床应用效果，并报告了其对胰腺癌检测的敏感性（47.8%~75.0%）和特异性（94.6%~96%）。Chausovsky等报道，上皮相关分子CK-20 mRNA可用于检测胰腺癌中的CTC。他们成功地证明了通过检测胰腺癌患者的血液标本，CK-20的RTPCR结果可以作为一项潜在的用于检测胰腺癌转移的生物标志物，而且后续的一系列工作支持了这一结果。另外，他们还报道了其他的mRNA，如上皮生长因子受体mRNA，α1，4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶mRNA和CK-19 mRNA，通过RT-PCR技术，可作为针对胰腺癌患者的检测CTC的有用靶标。就目前这些基于mRNA的研究来看，尽管mRNA具有高度特异性，但是敏感性变化广泛。Zhou等最近提出，用免疫磁珠富集后的RT-PCR检测c-Met，h-TERT，CK20和CEA可以作为检测胰腺癌患者CTC的指标，其灵敏度为100%，特异性为100%。

同时，免疫细胞化学法也被用于鉴定胰腺癌患者的CTC。许多研究机构已经开始研究CellSearch平台在胰腺癌患者中的临床应用效用，发现CTC检测率较低，从5%到42%不等。同时，一些研究机构通过报告CTC的阳性率与疾病复发和（或）生存不良相关，证明了CTC作为疾病复发和不良预后预测因子的临床应用效用。为了改善CellSearch系统在胰腺癌患者中CTC的检出率，一些研究人员已经开发了用于检测CTC的新兴技术，例如基于细胞大小的分离技术和微流体技术，并报告了良好的结果。

总体来说，CTC作为胰腺癌的生物标志物在一定程度上得到了认可，然而，在CTC被投入到临床应用之前，还有待解决以下几个问题。首先，由于其低灵敏度，CTC可能不适合用于早期检测的筛选测试（这在胰腺癌中是期望得到的），因此，需要具有高灵敏度的检测CTC的新技术，使得CTC的检测可以作为胰腺癌早期诊断的筛选测试。其次，CTC的检测必须克服CTC的稀有性和异质性，而且由于CTC的检测方法仍处于发展阶段，所以其研究方法和研究结果差别很大。因此，评估、比较和解释多项研究的结果，并建立CTC的循证医学数据是困难的。所以，为了更广泛的临床应用，需要建立统一的方法和大规模试验去验证其实用性。

四、CFNAS的生物学和检测

几十年来，人们已经确定cfNA存在于外周血中。Mandel和Metais首先于1948年报道了核酸在人血浆中是可以检测到的。1977年，Leon等人在癌症患者血清中检测到无细胞DNA。从那时起，几项研究已经确定了各种癌症患者的循环cfNAs的肿瘤特异性和（或）肿瘤相关性改变。1989年，Vasioukhin等成功地检测到具有肿瘤特征的无细胞DNA，提供了第一项证据表明肿瘤可以将DNA脱落到循环血中。一项研究进一步支持了这一假设，在患有骨髓增生异常综合征或急性骨髓性白血病的患者的血浆中检测到NRAS突变和胰腺癌患者血浆或血清中检测到KRAS突变。

目前，在血液中已经成功地检测到无细胞RNA，因为RNA在血浆/血清中容易被内源性核糖核酸酶（RNase）降解，因此比DNA更脆弱。1999年，成功地检测到了恶性黑色素瘤患者血清中酪氨酸酶mRNA和鼻咽癌患者中EB病毒相关RNA的存在。随后，许多研究已经证明特定的mRNA存在于患者的血浆/血清中，同时证明了其在各种癌症患者中的应用价值。

对于非编码RNA，Mitchell等人于2008年首先证实了循环微小RNA（miRNA）有可能成为实体癌症患者的新型生物标志物。从那时起，人们已经进行了大量关于循环非编码RNA的研究，大多数是针对miRNA。尽管其他非编码RNA，如小核仁RNA（snoRNA）、小核RNA（snRNA）、piwi相互作用RNA（piRNA）和长非编码RNA（lncRNA）已经被认为具有生物学功能，也可能具有很大的潜力成为新型血液生物标志物，但针对这些非编码RNA的报道很少，需要进一步研究和积累证据。

五、血浆/血清中的循环细胞免疫DNA和胰腺癌

关于血浆/血清中循环无细胞DNA的研究涉及两个主要策略：测量循环中无细胞DNA的量和检测肿瘤衍生的遗传突变，例如点突变、等位基因不平衡、微卫星不稳定性、遗传多态性、杂合性缺失和甲基化。在这些改变中，许多报道已经证明，在癌症患者血流中的循环无细胞DNA存在遗传和表观遗传的改变。

在1983年，Shapiro等人首先报道了胰腺癌患者中循环无细胞DNA的存在。本研究表明，与正常对照组相比，胰腺癌患者的血清DNA浓度明显升高，血清中异常高浓度的DNA可能具有诊断和预后价值。此后，血浆/血清中肿瘤衍生遗传改变的研究已成为主流。只有少部分研究针对甲基化、微卫星不稳定性以及等位基因失衡。相比之下，血浆/血清中K-ras突变的检测似乎是胰腺癌诊断中应用最广泛的方法。目前广泛认为，超过90%的胰腺癌包含突变的K-ras基因，而且突变型K-ras基因的检测可以提供在胰腺组织中胰腺腺癌的明确诊断。基于肿瘤组织中K-ras突变的检测，已经开始尝试将检测循环中无细胞DNA的肿瘤衍生遗传改变技术用于胰腺癌的诊断。1993年，Yamada等证明，血浆中K-ras突变的检测在临床上可用于评估肿瘤负荷和治疗胰腺癌的疗效。随后，许多研究小组已经报道循环无细胞DNA K-ras突变在胰腺癌中的可能临床应用效用。

PCR已被广泛用于检测肿瘤衍生的突变基因，这些基因是从患者的血清和血浆分离的癌基因。最近，已经证明液滴数字PCR和全基因组高通量测序可以作为一种检测工具用于稀有突变和多种类型的循环DNA的检测，而且具有很高的准确性。通过在几种实体癌症如结肠直肠癌、乳腺癌和卵巢癌中使用这些新的技术，已经发现了治疗中患者血液中游离DNA的遗传突变和耐药性获得之间的相关性。希望在胰腺癌中可以证实无细胞DNA可有效用于评估残留疾病、复发和耐药性获得以及疾病的检测。

六、血浆/血清中的循环无细胞mRNA和胰腺癌

虽然RNA容易被RNA酶降解而且癌症患者血液中RNA酶的浓度很高，但是许多研究组已经证实癌症患者血液中的确有无细胞mRNAs的稳定存在。最近，已经证实这些RNA可以被并入外来体、微泡和多颗粒中，而且似乎被充分保护起来，所以免受了大量RNA酶引起的降解并从细胞表面释放出来进入到血液中。目前，有许多研究组正在研究血液中的无细胞mRNA与多种实体癌症之间的相关性，而且这些研究的目的主要是研究在癌组织的血浆/血清中被上调的mRNA。对于胰腺癌，有几项研究认为外周血单核细胞的mRNA和CTC可以作为检测CTC的一个标记；然而，血浆/血清中无细胞mRNA的数量非常少。Kang等最近证实，根据肿瘤特异性选择性剪接，血清中的Ⅳ型胶原蛋白（COL6A3）mRNA可能作为检测胰腺癌的生物标志物。证据的积累以及对无细胞mRNA的进一步理解可能为针对胰腺癌的液体活检领域带来新的见解。

七、血浆/血清中的循环非编码RNA

目前已经发现，多达80%的基因组DNA被转录成RNA。但是，人类基因组计划发现蛋白质的基因开放阅读框不到32亿碱基的2%，因此，大部分人类基因组DNA不编码蛋白质。现在越来越多的证据显示，许多非编码RNA（ncRNA）在许多细胞的发生发展过程中起着重要作用，并不仅仅是遗传信息从DNA转移到蛋白质的中间体，这就表明ncRNAs的表达方式可以作为分子特异性诊断方法。

对于循环ncRNA，几乎所有的研究都集中在miRNAs，这些miRNA是在各种生理和发育过程中发挥重要作用的短非编码RNA。成熟miRNA中的一条链（指南链）掺入RNA诱导的沉默复合物中，随后与其靶mRNA的3′非翻译区杂交，以抑制翻译或降解这些mRNA。因此，单个miRNA可以影响数百个基因的表达，并允许它们以协调的方式起作用。因此，miRNA被认为是所有细胞发生发展过程中的关键分子。许多研究表明，miRNA表达的改变与各种疾病相关，包括癌症的发生和发展，一些miRNA可以作为致癌基因或肿瘤抑制因子发挥作用。此外，最近的一些研究已经证明，一些细胞外miRNA的出现不仅通过细胞裂解还可以通过主动分泌。细胞衍生的内源性miRNA以明显稳定的形式存在于血液中，其被保护并免于内源性RNA酶的降解。Kosaka等人证明，一系列的miRNAs可以被包装在外来体囊泡中，并通过神经酰胺依赖的分泌机制释放。此外，大多数miRNA由于与蛋白质如Argonaute2和高密度脂蛋白的结合而在血浆中稳定存在。所有循环的miRNA无论是否并入蛋白质复合物和（或）细胞来源的微泡中，似乎都被充分保护起来，并免遭人血浆和血清中大量核糖核酸酶的降解。这些发现为癌症诊断和癌症患者的治疗开辟了一个新的有趣的领域。

Mitchell等人于2008年首先证实了循环miRNA可能成为实体癌症患者的新型血液生物标志物。自此以后，已经进行了大量关于癌症循环miRNAs的研究，以研究其作为候选新型生物标志物的潜力。在以前的报道中，Wang等人首先报道了胰腺癌组织中上调的四种候选miRNA（miR-21，-155，-196a和-210）的血浆水平。从那时起，有几个研究组已经报道了循环miRNA作为胰腺癌生物标志物的临床效用，研究的数量和miRNA的种类一直在增加。许多研究已经证明miRNA在血浆/血清中的失调表达的临床意义，并且已经报道了超过30种miRNA可以作为胰腺癌候选新型血液生物标志物。如前所述，一个miRNA可以调节多个mRNA，并且由于分析技术的最新进展，被发现的miRNA和靶mRNA的数量仍在增加。因此，最近几年，已经开始尝试使用多个miRNA以得到诊断胰腺癌的更高灵敏度和特异性。Schultz等报道发现，基于全血表达的miRNA，包括四个（miR-145，miR-150，miR-223和miR-636）和10个（miR-26b，miR-34a，miR-122，miR-126，miR-145，miR-150，miR-223，miR-505，miR-636和miR-885.5p），可用于胰腺癌的检测，而且具有高灵敏度和特异性。然而，应该这样认为，本研究是采用全血作为提取RNA的样品，所以，发现的miRNA明显地包括了来自除了无细胞的miRNA以外的血细胞或CTC的miRNA。Kojima等报道，8种miRNA（miR-6075，miR-4294，miR-6880-5p，miR-6799-5p，miR-125a-3p，miR-4530，miR-6836-3p，和miR-4476）的联合检测可以实现胰腺癌检测的高灵敏度，特异性和准确性。

此外，关于胰腺癌患者中的循环免疫miRNA的研究已经证明循环miRNA可以作为分期、治疗和预后标志物，以及作为检测胰腺癌的生物标志物。Kong等研究表明，血清的miR-196A的表达水平具有预测患者平均存活时间的潜在价值[胰腺癌高水平的miR-196A，6.1个月（95%CI：4.49~7.72个月）vs.低水平miR-196a，12个月（95%CI：5.92~18.08个月），P=0.007]。最近，有研究小组发现，miR-744在血浆中的高表达可能是筛选胰腺癌，监测和预测胰腺癌患者不良预后和化疗耐药性的有用生物标志物。

miRNA以外的一些非编码RNA已被认为具有生物功能。特别是在癌症中，一些非编码RNA已被证明具有致癌或肿瘤抑制功能，并在肿瘤组织中被解除调节。对于胰腺癌，据报道HOTAIR、MALAT-1、MEG3、GAS5、HULC、PVT1、PPP3CB、MAP3K1、DAPK1、BC008363、ENST00000480739和HSATII具有肿瘤相关功能和肿瘤特异性表达。然而，目前没有研究针对胰腺癌患者血液中这些无细胞RNA。在胰腺癌患者血液中，除了miRNA之外的非编码RNA，如长时间非编码RNA（lncRNA），小核仁RNA（snoRNA），小核RNA（snRNA）和Piwi相互作用的RNA（piRNA）在很大程度上仍然未被探索。最近，Wang等证实，lncRNA，HOTTIP-005和RP11-567G11.1的血浆片段有潜力被用作胰腺癌的诊断生物标志物。我们相信未来胰腺癌循环非编码RNA的研究将为这一领域带来新的见解。

对于该领域的发展，胰腺癌似乎是理想的癌种主要源于以下几个原因。首先，因为解剖和临床上的困难，使用从外科手术或活检标本获得的组织样本进行的肿瘤相关遗传突变的研究是昂贵且困难的。此外，由于灵敏度和特异性的不足，目前的血清生物标志物的用途是有限的。胰腺癌循环非编码RNA具有高灵敏度和特异性，而且可重复和较少侵入性，以及研究获得的关于遗传突变或肿瘤动力学的信息有助于大大改善胰腺癌的治疗。其次，我们已经发现，大多数胰腺肿瘤细胞中存在一些遗传或表观遗传改变，如KRAS、p16、SMAD4、TP53和CDKN2A，这可能易于确认肿瘤衍生的分子靶点。第三，遗传进化模型揭示了从发生突变到患者死亡需要10~30年。此外，黏液性囊性肿瘤、导管内乳头状瘤、胰腺上皮内瘤变（IPMN）和导管内乳头状管状肿瘤被认为是胰腺癌的癌前病变，胰腺癌又通过几个遗传突变的逐步积累进展到侵入性胰腺癌。如果通过液体活组织检查可以发现这些重要的遗传突变，便可以实现对高风险病变或早期检测的筛选和监测。迄今为止，关于在胰腺癌的这些癌前病变中应用液体活检技术的报道很少。最近有研究已成功地证明了血浆miR-223可以预测IPMN的恶性潜能。我们认为，针对胰腺癌癌前病变液体活检的进一步研究有助于改善胰腺癌患者的预后。

总体而言，液体活检有可能让我们早期进行诊断、预测预后、跟踪治疗功效或药物抵抗力等，为癌症患者提供最佳的个体治疗策略，即量身定制治疗方案。液体活检的发展可为癌症患者，特别是胰腺癌患者提供许多益处。

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